Analyse van allergenen

Nutrilab is expert in allergenen analyses. Allergenen zijn, over het algemeen, eiwitten die allergische reacties kunnen opwekken. De Europese Unie heeft in richtlijn 1169/2011/EG bepaald dat de voedselallergenen die de meeste overgevoeligheidsreacties veroorzaken op een etiket dienen te worden vermeld. Allergenenonderzoek bij Nutrilab wordt uitgevoerd met behulp van analysetechnieken als ELISA, PCR en LC-MS/MS. Door het gebruik van gevalideerde methoden en veel kennis van alle levensmiddelenproducten, levert Nutrilab betrouwbare resultaten. Sinds lange tijd is Nutrilab het huislaboratorium voor de Nederlandse Coeliakie Vereniging. Nutrilab heeft de mogelijkheid de volgende allergenen te analyseren: 

Meetbereik van allergenen

Allergenen analyses hebben een beperkt meetbereik en zijn feitelijk bedoeld voor bepaling van contaminatie op laag niveau. Als op het lab uitslagen gemeten worden dit buiten het standaard meetbereik vallen, zal automatisch een heranalyse ingezet worden met extra verdunning. De kosten hiervoor worden aan u doorberekend.

Aanleveren in een goede verpakking van groot belang

Een betrouwbare analyse van allergenen begint bij de monstername. Door het gebruik van de juiste materialen kan contaminatie worden voorkomen. Lees hier meer over het aanleveren van monsters voor allergenen analyses. 

Welke analysemethode moet ik kiezen?

Voor het verkrijgen van een correct analyseresultaat is het van groot belang dat je juiste methode wordt gebruikt voor het analyseren van uw product. Hier leest u meer over hoe u die keuze het beste kunt maken.

Wat is het principe van een ELISA-analyse

De basis van een ELISA-analyse is een antigen-antilichaam reactie. De wells van de gebruikte microtiterplaat zijn gecoat met de specifieke antilichamen voor het te analyseren allergeen. Door standaarden of monsteroplossing toe te voegen, bindt het daarin aanwezige allergeen aan de specifieke antilichamen op de wand van de well. Monstercomponenten die niet binden, worden weggewassen door een wasstap. Het gebonden allergeen wordt gedetecteerd met een ander antilichaam waaraan het enzym peroxidase is gebonden. Dit antilichaam bindt zich aan het reeds gevormde antilichaam-antigen-complex, waardoor zich een antilichaam- antigen-antilichaam-complex (sandwich) vormt. Het ongebonden conjugaat (enzym) wordt weggewassen door een wasstap. Vervolgens worden enzymsubstraat (urea peroxide) en chromogeen (tetramethylbenzidine) toegevoegd. Tijdens de incubatie zet het gebonden enzym het kleurloze chromogeen om in een complex met een blauwe kleur. Als laatste wordt een stopoplossing toegevoegd die ervoor zorgt dat er geen verdere kleurreactie meer plaatsvindt. De kleur slaat om naar geel. De kleur wordt gemeten met een fotospectrometer bij 450 nm. De gemeten extinctie is een maat voor de allergeenconcentratie in het monster. Door het meenemen van standaarden wordt het allergeengehalte kwantitatief bepaald.

Wat is het principe van een PCR-analyse

Voor de detectie van allergenen wordt gebruik gemaakt van real-time PCR. Voor deze techniek wordt DNA uit producten geïsoleerd. Voor de PCR wordt een mix gemaakt van buffer, DNA, primers, nucleotiden (bouwstenen van DNA), polymerase en een fluorescente kleurstof. Afhankelijk van het allergeen dat wordt geanalyseerd, zijn specifieke primers in de PCR aanwezig. Met deze primers wordt in korte tijd veel kopieën gemaakt van het allergeen DNA. Door DNA van standaarden en DNA uit de producten in de PCR toe te voegen en deze een temperatuurprogramma te laten doorlopen, worden kopieën gemaakt. Deze kopieën zijn te meten in de reactie doordat de fluorescente kleurstof en de kopieën van het DNA samen een signaal afgeven. Hoe meer kopieën in de reactie, hoe sterker dit signaal. Wanneer het allergeen niet aanwezig is in het product, zullen geen kopieën gemaakt kunnen worden en zal er geen signaal te meten zijn. Hierdoor kan worden geanalyseerd of een allergeen wel of niet in het product aanwezig is.

Nutrilab ontwikkelt door op het gebied van allergenen

Nutrilab heeft, in samenwerking met de Wageningen Universiteit BU Bioscience, een methode ontwikkeld om >21 allergenen te meten in één run met LC-MS/MS. Het grote voordeel van deze methode is dat de kostprijs voor het analyseren van meerdere allergenen in een monster sterk wordt verlaagd. De methode heeft verder meerdere voordelen ten opzichte van de conventionele technieken ELISA en PCR.

De methode omvat de analyse van alle eiwit gebaseerde allergenen uit richtlijn 1169/2011/EG en enkele allergenen voor niet Europese markten.

De LC-MS/MS methode van Nutrilab voor allergenen gebruikt drie of meer verschillende eiwitfragmenten (peptiden) van het betreffende allergeen. Voor elke peptiden wordt minimaal gebruik gemaakt van 2 of meer massaovergangen voor de MS (Massaspectrometer). Tevens wordt voor de beoordeling gebruik gemaakt van de verhouding tussen de diverse allergene eiwitten in een monster. 

Met pinda als voorbeeld wordt dit duidelijk. Pinda bevat veel verschillende eiwitten. De allergene eiwitten in pinda zijn voornamelijk AraH1, AraH2, AraH3, AraH4, AraH5 en AraH6. Deze eiwitten komen in pinda in een vaste verhouding voor. Door de analyse van de aanwezigheid van deze eiwitten en de verhouding, wordt een zeer hoge mate van betrouwbaarheid en selectiviteit behaald.

Allergenenwetgeving, een richtlijn van de NVWA voor referentie dosis voor allergenen

De NVWA heeft in 2016 advies uitgebracht voor allergenen. Het is een publicatie van het Bureau Risicobeoordeling en Onderzoeksprogrammering (BURO). Het bureau geeft advies aan de NVWA voor het huidige allergenen beleid. Nutrilab geeft uitleg aan het document Advies Allergenen 02062016. Het betreft een advies voor voorlopige referentie dosis.

Uitleg referentie dosis allergenen

Een referentiedosis is gebaseerd op het voorkomen van allergische reacties van een klein percentage van de allergene bevolking. De referentiedosis bepaald de hoeveelheid allergeen dat in een voedingsmiddel mag voorkomen per dag. Het gehalte aan een specifiek allergeen is afhankelijk van de genuttigde hoeveelheid. De genuttigde hoeveelheid is weer afhankelijk van de leeftijd en het geslacht.  De portiegrootte per product waarvan uitgegaan kan worden, is te vinden op de website van het RIVM: ‘Voedsel Consumptie Peilingen’. 

Een voorbeeld: een vrouw met een leeftijd tussen 19-30 jaar eet ‘gemiddeld’ 186 gram graan of graanproducten per dag (brom: Publicatie VCP: basis 7-69 jaar 2007-2010). Volgens de NVWA publicatie mag voor iemand met een pinda allergie, maximaal 0.015 mg pinda eiwit consumeren (zie tabel in dit artikel). De graan mag voor vrouwelijke personen dan maximaal 1000/186 x 0.015 mg pinda eiwit bevatten: 0.08 ppm  (de onderste bepaalbaarheidsgrens/detectielimiet of LOQ is voor pinda 2.5 ppm; zie tekst hieronder voor advies aan voedingsmiddelen fabrikant). Een man met de leeftijd tussen 19-30 jaar eet ‘gemiddeld’ 256 gram granen of graanproducten per dag. Het maximaal gehalte aan pinda eiwit allergeen in graan mag voor een man dus 1000/256 x 0.015 mg : 0.06 ppm zijn.  Op deze wijze moet dus voor elk product berekend worden wat het maximale gehalte van een allergeen in een product mag zijn. De voedselproducten moet dus flink gaan rekenen. Maar ook een oordeel vellen over wie zijn/haar product in welke hoeveelheid consumeert.

Tabel met referentiedosis allergenen 

Advies voor allergenen analyse voor de voedingsmiddelen fabrikant

Volgens het BURO zijn de meeste referentiedosis onder de bepaalbaarheidsgrens van de analyses. Voor cashewnoot, lupine, sesam en garnaal zou het kunnen voorkomen dat de referentiedosis boven de bepaalbaarheidsgrens/detectielimiet ligt. In alle gevallen geeft een analyse op het product de waarde weer, zodat kan worden gecontroleerd of aan de voorlopige eis van de NVWA wordt voldaan. Wanneer berekend wordt hoeveel van een allergeen als restproduct aanwezig zou kunnen zijn, moet in principe uitgegaan worden van de referentiedosis. Echter zal handhaving op dat niveau niet mogelijk zijn omdat de onderste bepaalbaarheidsgrens /detectielimiet  boven de vereiste waarde ligt, dus is de detectielimiet de controlegrens. Een waarde schatten kan door middel van berekenen, de waarde bepalen kan door analyse. Neem hiervoor contact op met Nutrilab via het contactformulier elders op de website.

Maximale gluten en tarwe gehalte in voedingsmiddelen en de wetgeving voor etikettering, claim op het etiket

De referentiedosis voor tarwe kan mogelijk tot verwarring leiden. Dat heeft te maken met het onderscheid tussen tarwe allergie en gluten intolerantie bij Coeliakie patiënten. Voor Tarwe allergie is een referentiedosis opgenomen van 0.14 mg. Los daarvan blijft volgens de EU richtlijn 828/2014, die per 20 juli 2016 gehandhaafd wordt, onverminderd van kracht dat de claim op het etiket ‘Glutenvrij’ mag worden gevoerd bij < 20 ppm gluten en de claim ‘laag gluten’ mag worden gevoerd bij < 100 ppm gluten in een product.