Help! Welke analysemethode moet ik kiezen?

Voedingsproducenten zijn verplicht de aanwezige allergenen te vermelden op het etiket van de producten die zij produceren. De Europese Unie heeft dit in richtlijn 1169/2011/EG vastgelegd. Om dit correct te kunnen vermelden, worden in veel gevallen productmonsters naar een laboratorium opgestuurd ter analyse. Laten we ervan uit gaan dat u hiervoor de diensten van Nutrilab gebruikt. Binnen ons laboratorium gebruiken we verschillende methoden om allergenen te analyseren. Het is niet zo ingewikkeld om voor uw product een analyserapport te krijgen met “niet aangetoond” maar belangrijker is of de analyse ook correct is. Hiervoor is kennis van de gebruikte technieken en de te analyseren producten essentieel. Maar welke techniek is geschikt voor het product dat u produceert en wilt laten testen? Daar gaan we in dit artikel uitgebreid op in. 

“Ik wil mijn product laten onderzoeken op aanwezigheid van allergenen. Fijn dat Nutrilab meerdere methoden heeft om allergenen te kunnen analyseren maar welke moet ik kiezen?”

Een goede en terechte vraag. Bij Nutrilab zijn we expert in het analyseren van allergenen. Niet voor niets zijn we sinds lange tijd het huislaboratorium voor de Nederlandse Coeliakie Vereniging. Simpel gezegd zijn er 3 analysetechnieken waar we allergenen mee kunnen detecteren binnen ons laboratorium. De ELISA, PCR en LCMS-MS methode. We lopen ze alle drie even kort langs om de verschillen te duiden:

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 

De ELISA-techniek is tot op de dag van vandaag eigenlijk de standaard en meest gangbare methode voor het analyseren van allergenen. De ELISA-techniek maakt gebruik van specifieke antilichamen tegen een voedselallergeen. De basis van deze analyse is een antigen-antilichaam reactie. De antilichamen uit de testkit binden aan het allergene eiwit en zullen in de reactie gemeten worden. Door het gebruik van antilichamen tegen het allergeen, wordt het allergene eiwit gedetecteerd. Dit eiwit veroorzaakt een allergische reactie.

Polymerase chain reaction (PCR)

De PCR-techniek detecteert allergenen op moleculair niveau. In tegenstelling tot ELISA bepaalt PCR niet rechtstreeks de aanwezigheid van een allergeen. De techniek lokaliseert de genen in het DNA die verantwoordelijk zijn voor de productie van allergene eiwitten. Voor de detectie van allergenen wordt gebruik gemaakt van real-time PCR. Er wordt een mix gemaakt van buffer, DNA, primers, nucleotiden (bouwstenen van DNA), polymerase en een fluorescente kleurstof. Afhankelijk van het allergeen dat wordt geanalyseerd, zijn specifieke primers in de PCR aanwezig. Met deze primers wordt in korte tijd veel kopieën gemaakt van het allergeen DNA. Deze kopieën zijn meetbaar gedurende de run op de PCR.

LC-MS/MS analyse

De detectie van eiwitfragmenten (peptiden) is de basis van de LC-MS/MS methode. Voor de detectie van een allergeen wordt gebruik gemaakt van drie of meer verschillende peptiden van een allergeeneiwit. Voor elke peptiden wordt minimaal gebruik gemaakt van 2 of meer massaovergangen voor de MS, oftewel de Massaspectrometer. Tevens wordt voor de beoordeling gebruik gemaakt van de verhouding tussen de diverse allergene eiwitten in een monster. Met deze techniek kan in sommige gevallen de bron van een allergeen bepaald worden. Bijvoorbeeld voor gluten kan bepaald worden of de oorsprong in gerst, haver, rogge, spelt of tarwe ligt. De specificiteit en het aantal parameters wat in een run getest kan worden is een groot voordeel van deze techniek.

In een recent gesprek met Laura Boender, teamleider van de Allergenen afdeling binnen Nutrilab , gaan we dieper in wat er gebeurd met een monster vanaf het moment dat het bij ons op het laboratorium aankomt en waar u als producent aan moet denken als er monsters aangeboden wordt ter analyse. U kunt dit artikel hier nog eens rustig nalezen.

“Maar welke analysemethode is passend voor het product dat ik maak?”

U wilt als producent immers zeker zijn dat uw product vrij is van allergenen of dat de aanwezige allergenen gedeclareerd worden op het etiket zodat de voedselveiligheid maximaal geborgd is en de consument niet onnodig in gevaar komt.

Het antwoord op deze vraag hangt van een aantal factoren af. Zoals eerder gezegd is de ELISA methode eigenlijk de meest gangbare methode. Alleen heeft iedere specifieke kit die gebruikt wordt zijn eigen beperking. Kruisreacties zijn de grootste beperkingen van de ELISA kits. Echter met voldoende kennis van het te onderzoeken product en de kruisreacties van de testkit komen we een heel eind. We raden u daarom aan om vooraf contact op te nemen met Nutrilab als deze kennis op de kwaliteitsafdeling zelf niet aanwezig dit. Dit om vals positieve, of erger nog, vals negatieve analyseresultaten te voorkomen.

Een aantal voorbeelden van uitzonderingen die wellicht helpen om dit beter de begrijpen:

Allergeen Soja

Alle testkits die Nutrilab gebruikt hebben een uitgebreide handleiding met validatie waar de prestatiekenmerken en kruisreacties in beschreven staan. Deze zijn vaak wel op basis van pure grondstoffen. Aangezien we steeds meer met ‘processed food’ te maken hebben worden ook de kruisreacties complexer en lijken deze in de resultaten misschien soms zelfs willekeurig.

Een belangrijke beperking van onze geaccrediteerde soja ELISA analyse is de kruisreactie met bonen en linzen. Als uw product dus bijvoorbeeld bonen bevat kan er een vals positief resultaat gerapporteerd worden omdat de antilichamen binden aan het eiwit uit de bonen. Wij proberen, mede door het publiceren van dit artikel, onze klanten zo goed mogelijk te informeren hierover zodat er geen producten ten onrechte afgekeurd of geblokkeerd worden. Het is niet zo heel moeilijk om een analysecertificaat te bemachtigen. Er zijn immers tal van laboratoria die een allergenen analyse voor u kunnen uitvoeren. Maar om ook daadwerkelijk een correct resultaat met een analysemethode dat past bij het product dat u produceert of voldoet aan de specificaties van uw leveranciers is vaak een grotere uitdaging. Dit vraagt vaak net even wat meer kennis en oplettendheid van zowel klant als laboratoria. Door bij twijfel even contact met ons op te nemen kunnen we een boel narigheid voorkomen.

Allergeen Mosterd

Ook de ELISA testkit van het allergeen mosterd kan een vals positieve kruisreactie geven als het product wat onderzocht wordt kruisbloemigen bevat of in contact geweest is met deze soort. Een tijdje geleden ontstond er wat paniek over mogelijke verontreiniging van tarwe uit Italië met het allergeen mosterd. Dit kan primaire verontreiniging zijn, dus vanuit de teelt, of ontstaan zijn bij het vervoer.

Hierbij kwam aan het licht dat een referentiemethode voor de identificatie van allergene eiwitten uit mosterd ontbreekt en dat bestaande testkits gebaseerd op ELISA of PCR niet voldoende specifiek zijn of zelfs vals-positieve resultaten kunnen geven. Hierdoor bleef onduidelijk wat de positieve uitslagen veroorzaakte, mosterd of een verwante kruisbloemige (Brassicaceae). In dit specifieke geval kon onderzoek met onze LCMS-MS methode uitsluitsel bieden. Hierbij kunnen we zelf specificeren om welk type mosterd het gaat. Onze LCMS-MS methode kan onderscheid maken tussen de volgende soorten:

Bruine mosterd (B. juncea)

Zwarte Mosterd (B. nigra)

Witte/gele (Sinapsis alba)

Wilde Mosterd of Herik (S. arvensis)

Ethiopische mosterd (B. Carinata)

Koolzaad (B. napus)

Raapzaad (B. rapa)

Op deze manier konden we naast het aantonen van het allergeen ook bijdragen aan het terugvinden van de oorsprong van de contaminatie.

Gluten

De allergenen analyse die het meest bij ons op het laboratorium wordt uitgevoerd is de gluten analyse. Honderden samples gaan er per week door de handen van onze analisten. Maar ook de standaard gluten analyse heeft een beperking in de testkit. Dit is specifiek van toepassing op de producten die verhit, gehydrolyseerd of gefermenteerd zijn. In deze processen worden de eiwitten van het allergeen al in stukjes gebroken. Hierdoor kan er niet op het volledige eiwit, maar op fragmenten van het gluteneiwit geanalyseerd worden. Er zijn verschillende laboratoria die dit onderscheid niet maken maar het is wel essentieel dit te doen voor een betrouwbaar analyseresultaat en om de consument te garanderen dat het product glutenvrij is.

Sinds 2022 voert Nutrilab naast de reguliere gluten ook de competitieve analyse onder accreditatie uit.

Conclusie?

De ELISA methode wordt nog steeds veruit het meest gebruikt voor het bepalen van allergenen in voedingsmiddelen. Indien voldoende kennis van het te analyseren product en de gebruikte testkit kunt u aan de hand van controle met deze methode betrouwbaar en voedselveilig uw product aan de markt leveren .

Indien vooraf bekend is dat het product ingrediënten bevat die een kruisreactie kunnen geven met de ELISA testkit kan afgeweken worden naar de PCR methode. Wat belangrijk is om u te realiseren dat hier echt op een andere manier het allergeen bepaald wordt en de resultaten moeilijk of iet te vergelijken zijn met ELISA. De PCR zoekt naar het DNA dat het allergeeneiwit produceert en niet het eiwit zelf.

Beide tests hebben echter de beperking dat per allergeen een losse analyse opgewerkt en ingezet moet worden. Indien dus uw product geanalyseerd moet worden op alle EU of non-EU allergenen raden wij zeker aan voor de LCMS-MS screening methode te kiezen. Dit is een screening waarbij vrijwel alle allergenen in 1 run gemeten worden. Omdat er veel preciezer naar peptiden van een eiwit gekeken wordt kunnen wij tevens beter onderzoeken wat de bron van de contaminatie is.

Heeft u vragen naar aanleiding van dit artikel? Neem dan gerust contact met ons op.